1.什么是酵母展示平台

酵母展示（或酵母表面展示）是一种强大的蛋白质工程技术，它是用整合到酵母细胞壁中的重组蛋白的表达来分离和工程化抗体。自 2000 年首次发表以来，酵母表面展示已被广泛用于设计各种蛋白质以提高亲和力、特异性、表达、稳定性和催化活性。

2.酵母展示原理

酵母抗体展示技术（Yeast Display Technology）是指用抗体序列可变区与凝集素Aga2p融合表达，Aga2p蛋白亚基通过两个二硫键与固定在酵母细胞壁上的Aga1p 蛋白亚基结合，结合流式分选技术，将靶向抗原的特异性抗体给筛选出来。

图1：酵母文库展示示意图

3.纳米抗体

纳米抗体（Nanobody, Nbs）是驼科动物外周血清产生的一种单链抗体，这些抗体仅由重链组成，缺乏轻链和功能性CH1和CH4结构域。VHH晶体为2.5nm，长4nm，分子量只有15KDa。相较于传统抗体，纳米抗体因其分子量小，从而更容易可穿透血脑屏障；原核或真核系统有高表达量；特异性强，亲和力高；对人的免疫原性弱等优点，因此在抗肿瘤药物研发、心脑血管疾病、免疫疾病等领域有巨大价值。

图2：纳米抗体的3D结构

4.纳米抗体酵母展示优缺点

4.1优点

（1）酵母作为真核表达系统，可以进行翻译后修饰来表达和折叠复杂的真核蛋白；

（2）相对噬菌体展示文库技术而言，酵母展示技术在微量抗体表达后抗体活性要高，得益此基础，在流式筛选时就能区分抗体的亲和力高低；

（3） 插入异源蛋白不会破坏表面蛋白的结构，也不会影响表面展示的效率。

4.2缺点

（1）相比于噬菌体展示技术，酵母展示库容量较低，因此主要应用于客户对项目库容要求不高，动物免疫后PBMC细胞经过二次分选以及避免漏掉二硫键形成的抗体发现项目；

（2）由于酵母表面存在多个蛋白质拷贝，可能会发生与寡聚蛋白靶标不希望的多价结合。

5.酵母抗体展示应用

随着这项技术的不断完善，现在酵母展示的应用包括酶工程；蛋白质表位作图、蛋白质-蛋白质相互作用的鉴定、免疫生物催化和生物传感器，以及用于生物技术和生物医学应用的酵母细胞上蛋白质和酶的展示。

6.泰克生物能够提供酵母抗体展示技术服务

泰克生物能够为客户提供高质量的纳米抗体酵母展示服务，主要服务流程如下：抗原准备，羊驼免疫，PBMC分离，RNA提取，cDNA制备，文库构建，文库筛选，抗体表达。

图3：酵母抗体展示文库流程图

5.1抗原制备

5.1.1密码子优化+基因模板合成+表达载体构建；

5.1.2质粒抽提+转染（哺乳表达系统）目的蛋白检测（WB，SDS-PAGE）；

5.1.3蛋白表达放大+蛋白亲和纯化。

5.2动物免疫

5.2.1动物免疫4次，加强免疫一针，共计免疫5针；

5.2.2免疫前采集阴性血清，第4针采血进行ELISA检测血清效价；

5.2.3若第4针血清抗体效价（蛋白抗原>10^5；多肽抗原>10^4）满足要求，则采血前7天再次加强免疫1针，如不满足要求，则继续常规免疫；

5.2.4效价合格，采血（＞100ml）分离单核细胞。

5.3 cDNA制备

5.3.1 PBMC总RNA提取（参照RNA提取试剂盒）；

5.3.2高保真RT-PCR制备cDNA（参照反转录试剂盒）。

5.4文库制备

5.4.1以cDNA为模板，两轮PCR扩增VHH基因；

5.4.2酵母表达质粒构建与转化： VHH基因拼接酵母展示载体，电击转化酵母宿主菌，构建抗体库，电击次数不低于10次；

5.4.3鉴定：随机挑选24个克隆，PCR鉴定阳性率+PCR鉴定多样性+插入率。

图4：VHH阳性率:>90%

5.5文库筛选

5.5.1磁珠分选；

5.5.2 FACS分选（免疫双标分选）；

5.5.3铺板+阳性克隆菌培养+抗体基因测序；（>20个，多达96个）。

5.6抗体表达

5.6.1将获得的抗体序列构建合适的表达载体（哺乳表达）进行表达+亲和纯化+抗体蛋白定量。