荧光显微成像具有高分辨率、高灵敏度、高分子特异性以及非介入性的优点，可以在微米乃至纳米尺度下表征样本的形态学与分子功能学信息，成为了生命科学研究的重要工具。

随着微观生物学研究的不断深入，荧光显微成像被期待能够动态且立体地观测微观生物结构与分子事件。

西安电子科技大学的闫天宇、何颖团队在《红外与激光工程》发表文章《快速三维荧光显微成像技术的研究进展（特邀）》，系统性地梳理了近年来快速三维荧光显微成像技术的研究进展，并展望了快速三维荧光显微成像技术的未来挑战与发展前景。

技术原理与应用

使用具有层析能力的荧光显微镜逐层成像获得图像堆栈，以CLSM和TPM为代表的扫描式显微镜具有更高的穿透深度、成像信噪比和光学切片能力，常用于细胞成像、在体组织成像、脑神经元研究等领域。

图1.点扫描式系统结构示意图及其典型应用结果。(a)激光共聚焦扫描显微镜结构图；(b)脑组织切片的多色共聚焦图像及三维重建结果；(c)单光子与双光子脑神经元体积成像，以及不同照明策略的成像深度

如Zhu等人使用自行合成的近红外二区造影剂在CLSM系统中实现对脑组织切片的三维体积成像；Yang等人将双光子光遗传学与双光子钙体积成像相结合进行在体三维测量和操纵小鼠大脑皮层的神经活动。

提高成像速度的方法

1、减少扫描维度：早期的线扫描策略可从一个方向屏蔽焦外信号，但会降低成像质量，提高机械扫描组件扫描转子的频率可获得更高的扫描速度。如Piyawattanametha等人开发的二维单晶硅扫描镜用于TPM和显微内窥镜中，Boutilier等人通过安装多面镜提高TPM水平方向上的快轴扫描速度。

2、多焦点并行扫描：同时偏转复数个光束进行多焦点并行式高速扫描。如Zhang等人使用扫描振镜和微透镜阵列实现400个焦点的并行式扫描，或使用转盘式扫描显微镜，如Oketani等人使用针孔阵列盘作为扫描单元进行快速成像。

图2.快速扫描技术的实现方式及其典型应用。(a)多焦点扫描装置；(b) 转盘式多焦点扫描；(c)快速扫描技术用于实时观测高尔基体的三维运动；(d)时间延迟多焦点扫描；(e)使用变焦透镜的轴向扫描；(f)通过变焦透镜实现小鼠神经元三维功能成像，180µm×180µm×165µm，时间分辨率:0.25s；(g)多焦点结构光照明显微镜对斑马鱼胚胎的三维成像结果，红色框内是正在分裂的细胞

3、时间延迟多焦点扫描：基于时间延迟的多路复用的多焦点扫描技术，允许高速高灵敏度的单点探测器采集多焦点的时间信号序列进行图像重构。如Wu等人在TPM中令非平行的脉冲激光束在反射镜之间多次反射以分离不同波矢方向的子脉冲，配合一维扫描振镜与光电倍增管实现快速采样。

4、提升轴向扫描效率：将变焦透镜引入成像系统通过高速变焦进行轴向快速扫描。如Chien将轴向扫描频率高达1MHz的可调谐声学梯度指数镜头应用于双光子显微镜中，或在照明光路中设置可沿光轴方向快速移动的反射镜结合多路复用技术，也可利用贝塞尔光等无衍射光束实现快速体积成像。

增强空间分辨率的方法

利用多焦点结构光照明显微镜、4Pi显微镜技术、受激辐射损耗显微镜等可实现超分辨三维成像，如York等人开发的多焦点结构光照明显微镜获得了145nm的横向分辨率，Velasco等人结合双光子照明、自适应光学和近红外荧光探针等技术获得了深度可达164μm的三维超分辨荧光显微图像。

存在的问题

提高扫描速度会导致单个采样点的光子产量及曝光时间下降，对光子预算的规划要求更为严格，系统的复杂化会导致成本提高。此外，超分辨技术应权衡分辨率、视野和成像时间之间的关系。

光片荧光显微镜

技术原理与优势

采用薄片状的照明光源替代常规显微镜中的柱形光源，只有在光片内部的荧光分子被高效率激发，产生较少的焦外信号，提高了图像对比度，且大幅度降低了对生物样本的光毒性，在横向上可由面阵探测器直接成像，采集图像堆栈只需执行一个维度的扫描，适合长时间实时成像。

图3.光片显微镜结构及典型体积成像结果。(a)传统光片显微镜的系统结构；(b)斑马鱼心脏的体积成像结果,包含二维图像序列(左)和三维重建结果(右)，比例尺：50μm；(c)斑马鱼心脏随时间变化的图像[51]，右侧折线图是心脏跳动动态，比例尺：30μm

如Liu等人将晶格光片显微镜与自适应光学相结合实现对大体积多细胞样本中亚细胞过程的无创无像差成像，Fei等人将像素超分辨技术加入到光片显微镜中实现对大体积样本的各向同性的高分辨率成像。

提高成像速度的方法

基于振镜和可变焦透镜的高速扫描策略可用于光片显微镜中，如Fahrbach等人利用透镜扫描实现对跳动的斑马鱼心脏内的平面进行快速成像；Haslehurst等人在光片显微镜中加入振镜进行快速轴向扫描并配合电控可调谐镜头同步采集图像；扩展景深也可提高成像速度，如Lin等人通过将轴棱锥加入到双光子光片荧光显微镜中产生拓展景深，Olarte等人通过使用波前编码技术在光片显微镜中扩展检测光学器件景深；

此外，单物镜式光片显微镜被开发出来，如Yang等人在落射式荧光显微镜中生成倾斜的光片并在像方光路选择区别于照明光路的视野实现单物镜光片显微镜，Cai等人在落射式荧光显微镜中生成沿轴向传播的光片照明并设置微镜阵列配合一维扫描实现单物镜、正入射式的光片显微镜。

光场荧光显微镜

技术原理与存在的问题：通过在像方光路中设置微透镜阵列的方式同时获取光的强度和角度信息，可在不执行扫描的条件下重建样本的三维信息，具有天然的速度优势，但三维成像能力以牺牲横向分辨率为代价，且在三维视场上的分辨率不均匀。

图4.光场显微镜结构及典型体积成像结果。(a)传统光场显微镜的系统结构；(b)蠕虫大脑不同深度的典型重建结果，比例尺：50µm；(c) 200Hz体积成像速率下的血流成像，200µm×200µm×200µm

提高分辨率的方法：通过反卷积的图像重建方法、数字自适应光学扫描光场相互迭代断层扫描的计算成像框架、在光路中加入衍射光学元件等可增强分辨率。如Prevedel等人通过反卷积的图像重建方法获得了1.4μm的有效分辨率，Wu等人提出的计算成像框架将光场显微镜的横向分辨率和轴向分辨率分别提升至了220nm和400nm，Pan等人通过在样品和显微镜物镜之间插入透射式光栅提升轴向分辨率，He等人通过在光场显微镜的傅里叶平面上放置衍射光学元件实现一种快照多焦光场显微成像方法获得较大的场深。

提高成像速度的方法：使用两个互相垂直的物镜同时获取正交光场进行双视图数据融合并反卷积、利用高分辨率的二维图像和低分辨率的四维光场图像通过反卷积和相位恢复的混合算法、结合光场显微镜与深度学习成像技术等可提高成像速度。

如Wagner等人使用两个互相垂直的物镜实现高达200Hz的无运动伪影体积成像，Geng等人利用混合算法将图像重建的计算速度提高了4倍，Wang等人结合光场显微镜与深度学习成像技术实现对跳动的斑马鱼心脏中的血流进行成像，体积成像速率也达到了200Hz。

提高图像质量的方法：光场显微镜可和其他先进照明策略结合以提升图像质量，如Truong等人构建基于光场的选择性体积照明显微镜降低背景噪声并获得分辨率增强效果，Wang等人将光片照明技术应用于光场显微镜使其成像对比度增强、信噪比提升，Zhang等人将共焦检测方案与光场显微镜结合获取光学切片能力以及提高成像深度。

宽场超分辨显微镜

结构光照明超分辨成像：通过对样本施加干涉条纹并相移来实现样本图像的超分辨率重建，二维结构光照明技术只能提升横向分辨率，三维结构光可重建出样本的三维超分辨率荧光图像，但对像差敏感，成像深度有限。通过将自适应光学技术引入到三维结构光照明成像中可消除像差，提高成像深度，如Lin等人通过将自适应光学技术引入到三维结构光照明成像中成功将其成像深度提高至80μm。

图5.三维结构光照明显微镜结构和超分辨技术典型成像结果。(a)代表性系统结构；(b)常规显微镜（左）和三维结构光照明显微镜（右）对荧光微球的成像结果对比；(c)转铁蛋白簇的动态三维超分辨成像结果，比例尺：50nm；(d)大鼠海马神经元成像结果，包括宽场成像（左）、经典光学涨落超分辨重建（中）和使用傅里叶差值的光学涨落超分辨重建（右）

单分子定位超分辨成像：对视野内的荧光分子进行稀疏性激发，使临近的荧光分子不同时发光，进而允许在每次成像时对零散的荧光分子以纳米级精度定位，成像进行成千上万次即可重构出一张超分辨图像。基于单分子定位的成像技术已被证明可以在横向和轴向均获得超分辨率能力，且可通过适用于单分子定位的盲修复图像重建方法降低对数据量的要求，提高成像速度，如庄小威等人提出的三维单分子定位超分辨成像方案实现了横向 30nm、轴向60nm的单分子定位精度，庄小威等人在2011年以类似的分辨率实现了0.5Hz的体积成像速率，Wang等人提出的盲修复图像重建方法可从低密度图像中恢复精细结构并提高成像速度。

光学涨落超分辨成像：通过捕捉独立分布的荧光分子的闪烁状态而实现分辨率增强，可直接使用宽场荧光显微镜采集的时间图像序列完成超分辨图像重建，具有低成本、适用广泛的优点，但分辨率提升效果受限于探测器像素尺寸，可通过基于傅里叶变换的插值方案突破像素尺寸的限制，提高分辨率增强的上限，如Stein等人提出的基于傅里叶变换的插值方案可重建出像素密度更高的图像且不会引入伪影。

宽场式三维荧光显微成像在克服传统宽场显微镜缺陷的同时，凭借更低的光毒性以及数据采集维度的优势，成为了实时体积成像的强有力工具，允许科研人员对微观视野下短暂的分子事件进行动态追踪。超分辨技术的加入则使得宽场显微成像可以在时间分辨率和空间分辨率之间进行取舍。

技术原理

类似于使用X射线的计算机断层扫描，在光学波段对样本进行多角度弹道式照明获取投影数据集可以对样本实现三维断层重建，即光学投影断层成像技术（OPT）。

图6.光学投影断层系统及典型三维重建结果。(a)传统光学投影断层系统的系统结构；(b)黑腹果蝇蛹的荧光三维重建结果

应用与优势

OPT已被证明可以用于某些光学透明度较高的活体生物进行全身断层重建，结合荧光标记技术，可对生物样本内部的光吸收和荧光信号进行三维追踪。

如Bassi等人利用OPT技术以无标记的形式实现对弱散射活体样本的血管网络的可视化与三维断层重建；Arranz等人利用OPT技术对黑腹果蝇蛹进行三维断层扫描并捕捉到蛹内头部外翻过程的体积图像；McGinty等人使用绿色荧光蛋白标记斑马鱼胚胎后成功对其进行包含荧光寿命信息的光学投影断层扫描。

相比于点扫描需要对样本进行数百万至数千万次采样才能重建出三维图像，结合OPT技术的三维荧光显微成像仅需获得数百个不同角度的投影即可完成采样并断层重建，并且可以检测厚度在毫米量级的样本。

提高成像速度的方法

1、减少数据采集时间：开发样品在旋转轴上的半自动精确定位方法，并结合数据采集后的自动校正算法，可减少数据采集时间并提高重建后的图像质量，如Cheddad等人开发的定位方法获得了0.01pixel的校正精度。

2、提高重建时对数据的利用效率：采用基于调制传递函数的频率截止滤波器作为重建时的附加滤波器，可在抑制重建伪影的同时降低对数据量的要求，提高数据采集速度，如Chen等人采用该滤波器将数据采集速度提高了4倍。

4、开发适用于有限角度投影以及稀疏投影的重建方法：基于各项异性全变分极小化的重建方法可在重建有限角度的投影数据时获得明显优于经典方法的图像质量。

如Chen等人提出的该重建方法；结合代数重建与先验信息的方法可减少采集投影的范围；如Wang等人通过优化样本固定方式提高活体样本的纵向检测能力并结合代数重建与先验信息的方法仅需采集130°范围内的投影即可重建出质量可接受的图像；基于稀疏视图数据的稀疏重建方案结合代数重建和全变分正则化的迭代重建方法，可减少用于重建的投影数量，如Chen等人提出的该方案用于重建的投影数量可降低至15个；基于两阶段深度学习网络的框架用于稀疏投影的重建与去噪，可进一步减少所需的投影数量，如Wang等人提出的该框架可将所需的投影数量进一步降低至9个。

图7.有限角度与稀疏采样的重建结果。(a)180°和130°范围内断层重建结果；(b)滤波反投影法使用180个投影数据的重建结果（左）和两阶段深度学习网络使用9个投影数据的重建结果（右）

存在的问题

OPT技术对样本的光学透过率要求较高，对于不透明的样本需要先进行透明化预处理，因此可以检测的活体样本的种类有限，并会丢失在透明化处理中被去除的生物信息。

现有技术方案在一定程度上已经允许对部分微观尺度上的生物分子事件进行三维动态跟踪，但仍存在一些因素在限制实时体积成像的进一步发展，包括数据处理的实时性较差、光学显微成像的深度受限、视场有限以及基于荧光标记的显微成像技术难以描述样本的全部分子事件等。

随着各种先进光学成像技术的发展与融合，实时三维光学显微成像将会有进一步突破，提供更加完善的微观生物信息。

内容来源：

闫天宇,何颖,王鑫宇,徐欣怡,谢晖,陈雪利.快速三维荧光显微成像技术的研究进展（特邀）[J].红外与激光工程,2022,51(11):20220546.Tianyu Yan,Ying He,Xinyu Wang,Xinyi Xu,Hui Xie,Xueli Chen.Research progress on fast 3D fluorescence microscopic imaging (invited)[J].Infrared and Laser Engineering,2022,51(11):20220546.