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免疫荧光技术操作步骤

作者:上海研谨生物科技有限公司 2011-01-14T00:00 (访问量:15138)

免疫荧光技术操作步骤

. 直接免疫荧光法测抗原

基本原理

将荧光素标记在相应的抗体上,直接与相应抗原反应。其优点是方法简便、特异性高,非特异性荧光染色少,相对使用标记抗体用量偏大。

试剂与仪器

磷酸盐缓冲盐水(PBS):0.01mol/LpH7.4

荧光标记的抗体溶液:以 0.01mol/LpH7.4 PBS 进行稀释

缓冲甘油:分析纯无荧光的甘油 9 + pH9.2 0.2M 碳酸盐缓冲液 1 份配制

搪瓷桶三只(内有 0.01mol/LpH7.4 PBS 1500ml

有盖搪瓷盒一只(内铺一层浸湿的纱布垫)

荧光显微镜

玻片架

滤纸

37℃温箱等。

实验步骤

1. 滴加 0.01mol/LpH7.4 PBS于待检标本片上,10min后弃去,使标本保持一定湿度。

2. 滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液,使其完全覆盖标本,置于有盖搪瓷盒内,保温一

30min

定时间(参考:30min)。

3. 取出玻片,置玻片架上,先用 0.01mol/LpH7.4 PBS 冲洗后,再按顺序过 0.01mol/L

pH7.4 PBS 三缸浸泡,每缸 3-5 min,不时振荡。

4. 取出玻片,用滤纸吸去多余水分,但不使标本干燥,加一滴缓冲甘油,以盖玻片覆盖。

5. 立即用荧光显微镜观察。观察标本的特异性荧光强度,一般可用“+”表示:

-)无荧光;(±)极弱的可疑荧光;(+)荧光较弱,但清楚可见;(++)荧光明亮;(+++

--++++)荧光闪亮。待检标本特异性荧光染色强度达“++”以上,而各种对照显示为(±)

或(-),即可判定为阳性。

注意事项

1. 对荧光标记的抗体的稀释,要保证抗体的蛋白有一定的浓度,一般稀释在 120-100

间,要自行摸索最佳梯度,建立最好的稀释比例,抗体浓度过低,会导致产生的荧光过弱,

影响结果的观察。

2. 染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化,染色时间可以从 10 min 到数

小时,一般 30 min 已足够。染色温度多采用室温(25℃左右),高于 37℃可加强染色效果,

但对不耐热的抗原(如流行性乙型脑炎病毒)可采用 0-2℃的低温,延长染色时间。低温染

色过夜较 3730 min 效果好的多。

3. 为了保证荧光染色的正确性,首次试验时需设置下述对照,以排除某些非特异性荧光染

色的干扰。

1)标本自发荧光对照:标本加 1-2 0.01mol/LpH7.4 PBS

2)特异性对照(抑制试验):标本加未标记的特异性抗体,再加荧光标记的特异性抗

体。

如果标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光, 待检标本呈强荧光,则为特异性阳性染色。

4. 一般标本在高压*灯下照射超过 3min,就有荧光减弱现象,经荧光染色的标本最好在当天观察,随着时间的延长,荧光强度会逐渐下降。

. 间接免疫荧光法测抗原

基本原理

染色程序分为两步,第一步,用已知未标记的抗体(待检标本)加到已知抗原(待检标本)

标本上,在湿盒中 37℃保温 30min,使抗原抗体充分结合,然后洗涤,除去未结合的抗体。

第二步,加上荧光标记的抗球蛋白抗体或抗 IgGIgM 抗体(通常为荧光标记的对应二抗)。

如果第一步发生了抗原抗体反应,标记的荧光标记的二抗就会和已结合抗原的抗体进一步结

合,从而可鉴定被检测抗原。

试剂与仪器

磷酸盐缓冲盐水(PBS):0.01mol/LpH7.4

缓冲甘油:分析纯无荧光的甘油 9 + pH9.2 0.2M 碳酸盐缓冲液 1 份配制。

荧光标记的抗人球蛋白抗体:以 0.01mol/LpH7.4 PBS 进行稀释

搪瓷桶三只(内有 0.01mol/LpH7.4 PBS 1500ml

有盖搪瓷盒一只(内铺一层浸湿的纱布垫)

荧光显微镜

玻片架

滤纸

37℃温箱等。

实验步骤

1. 滴加 0.01mol/LpH7.4 PBS 于未知抗原标本片,10min 后弃去,使标本片保持一定湿度。

2. 滴加以 0.01mol/LpH7.4 PBS 适当稀释抗体,覆盖未知抗原标本片。将玻片置于有盖搪瓷盒内,37℃保温 30min

3. 取出玻片,置于玻片架上,先用 0.01mol/LpH7.4 PBS 冲洗 1-2 次,然后按顺序过0.01mol/LpH7.4 PBS 三缸浸泡,每缸 5min,不时振荡

4. 取出玻片,用滤纸吸去多余水分,但不使标本干燥,滴加一滴一定稀释度的荧光标记二

5. 将玻片平放在有盖搪瓷盒内,37℃保温 30min

6. 重复操作 3

7. 取出玻片,用滤纸吸去多余水分,滴加一滴缓冲甘油,再覆以盖玻片。

8. 荧光显微镜高倍视野下观察,结果判定同直接法。

注意事项

1. 荧光染色后一般在 1h 内完成观察,或于 4℃保存 4h,时间过长 ,会使荧光减弱。

2. 每次试验时 ,需设置以下两种对照:

1 阴性对照:阴性血清+荧光标记物 (需有使用人员自行建立标准)

2 荧光标记物对照:PBS+荧光标记物

如果标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光, 待检标本呈强荧光,则为

特异性阳性染色。

3. 未知抗原标本片需在操作的各个步骤中,始终保持湿润,避免干燥。

4. 所滴加的抗体或荧光标记物,应始终保持在未知抗原标本片上,避免因放置不平使液体

流失,从而造成非特异性荧光染色。

Storage: Store at –20 ºC for one year. Avoid repeated freeze/thaw cycles. The

lyophilized antibody is stable at room temperature for at least one month and for greater

than a year when kept at -20ºC. When reconstituted in sterile pH 7.4 0.01M PBS or diluent

of antibody, the antibody is stable for at least six weeks at 2-4 ºC.

Important Note: This product as supplied is intended for research use only, not for use in

human, therapeutic or diagnostic applications.

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