蛋白质印迹（Western Blot）保姆级教程
Part1：实验方案
蛋白质免疫印迹（Western Blot）是利用抗原与抗体特异性结合的特点，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体，以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白。
我们的Western Blot实验方案包含蛋白提取、电泳、转膜、封闭、孵育抗体、检测（图1）及所涉及的试剂，为您的WB实验保驾护航。
图1、Western Blot实验步骤
● 蛋白提取
1、使用Trident Extraction Kits从样本（细胞或组织）中提取蛋白。
（注：根据蛋白与抗体的具体情况优化细胞数量以及上样量）
2、蛋白浓度定量，在-20℃或更低温度下冷冻保存。
3、在样品中加入Trident Sample Buffer，100℃煮沸5mins，使蛋白质变性；瞬时离心上样。
（注：必要时，使用前在Trident Sample Buffer加入二硫苏糖醇（DTT）或/3-巯基乙醇（2-ME））
● 相关产品
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货号 |
名称 |
规格 |
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GTX400005 |
Trident RIPA Lysis Buffer |
100ml |
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GTX400033 |
Trident RIPA Lysis Buffer (Low SOS) |
250ml |
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GTX00835 |
Trident High-Efficiency Exosome Precipitation Reagent |
20ml |
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GTX16357 |
Trident 6x Laemmli SOS Sample Buffer |
25ml |
● SDS-PAGE电泳、转膜
1、将30 µg蛋白或 100 ng纯化蛋白装入SDS-PAGE凝胶孔中。
在SDS-PAGE凝胶孔中加入适量的Trident Blue Prestained Protein Ladder (GTX16376) 或 Trident Prestained Protein Ladder（高范围：GTX50875 或标准范围：GTX49384）装入1个或多个额外的泳道中。
2、使用1x Running buffer以50-100 V的电压运行1-2小时。建议将电压调低并延长时间。可使条带更清晰，分辨率更高。
3、在Transfer buffer中将凝胶中的蛋白质转移到硝酸纤维素膜或甲醇漂洗过的PVDF膜上。
（可选：在进行下一步之前，通过 Ponceau Red染色确认蛋白质转移成功）
● 相关产品
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货号 |
名称 |
规格 |
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GTX16370 |
Trident 20% SOS (w/v) |
500ml |
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GTX50875 |
Trident Prestained Protein Ladder (High Range) |
500µI |
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GTX49384 |
Trident Prestained Protein Ladder (Standard Range) |
500µI |
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GTX16376 |
Trident Blue Prestained Protein Ladder |
500µI |
● 封闭、孵育抗体、洗膜
1. 封闭：在3%脱脂牛奶/PBST或Trident Universal Protein Blocking Reagent（GTX30963）中封闭30-60分钟。
2. 一抗孵育：将膜置于含适当稀释一抗的1%脱脂牛奶/PBST或Trident Universal Protein Blocking Reagent（GTX30963）中，在RT下孵育两小时或在4°C下过夜。
3. 洗膜：1x PBST ，一次10分钟，两次5分钟。
4. 二抗孵育：将膜置于含适当稀释二抗的1%脱脂奶/PBST 或Trident Universal Protein Blocking Reagent（GTX30963）中孵育1小时。
5. 洗膜：1x PBST ，三次，每次10分钟。
（注：Trident Universal Protein Blocking Reagent不含任何动物血清，适用于WB、ELISA、IHC和ICC/IF实验）
● 相关产品
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货号 |
名称 |
规格 |
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GTX30963 |
Trident Universal Protein Blocking Reagent (animal serum-free) |
100ml |
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GTX30977 |
Trident 10x PBST |
100ml |
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GTX30976 |
Trident 10x TBST |
100ml |
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GTX213110-01 |
Goat Anti-Rabbit lgG antibody (HRP) |
1ml |
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GTX213111-01 |
Goat Anti-Mouse lgG antibody (HRP) |
1ml |
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GTX224125-01 |
Rabbit Anti-Rat lgG antibody (HRP) |
1ml |
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GTX224126-01 |
Rabbit Anti-Chicken lgY antibody (HRP) |
1ml |
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GTX232040-01 |
Donkey Anti-Goat lgG antibody (HRP) |
1ml |
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GTX221666-01 |
EasyBlot anti Rabbit lgG (HRP) |
250µI , 50µI |
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GTX221667-01 |
EasyBlot anti Mouse lgG (HRP) |
250µI , 50µI |
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GTX628474-01 |
EasyBlot anti Rat lgG (HRP) |
250µI , 50µI |
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GTX628547-01 |
EasyBlot anti Goat lgG (HRP) |
250µI , 50µI |
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GTX628906-01 |
EasyBlot anti Sheep lgG (HRP) |
250µI , 50µI |
● 基于ECL成像
按照Trident plus Western HRP Substrate（GTX400006）或Trident femto Western HRP Substrate（GTX14698）来检测信号。
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货号 |
名称 |
规格 |
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GTX400006 |
Trident plus Western HRP Substrate |
500ml |
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GTX17435 |
Trident pico Western HRP Substrate |
100/500ml |
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GTX14698 |
Trident femto Western HRP Substrate |
100/200ml |
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