PCR扩增产物的鉴定

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    实验原理
    生物大分子如蛋白质、核酸、多糖等常以颗粒分散在溶液中．它们的净电荷取决于介质的H浓度或与其他大分子的相互作用。在电场中，带电颗粒向阴极或阳极迁移．迁移的方向取决于它们带电的符号．这种迁移现象即谓电泳。迁移的方式目前可以根据分子尺寸大小、分子所带的电荷或分子的生物学与化学特性分为三类。如果把生物大分子的胶体溶液放在一个没有干扰的电场中，使颗粒具有一定迁移速率的驱动力来自于颗粒的有效电荷Q和电位梯度E。它们与介质的摩擦阻力f抗衡：在自由溶液中，这种抗衡服从斯托克斯定律。f=6πrvη这里v是在介质粘度为η半径为r的颗粒的移动速度。但在凝胶中，这种抗衡并不完全符合斯托克斯定律。f还取决于介质小的其他因子，如凝胶厚度、颗粒尺寸、甚至介质的内渗率等。简言之电泳就是带电颗粒在电场中定向移动。
    银染显色的原理是用甲醛将沉积在DNA带上的银离子（**银）还原成金属银而显带。

    实验试剂
    1.聚丙烯酰胺（C=30%T=5%）：丙烯酰胺28.5g、N，N’-二甲基双丙烯酰胺1.5g、DDH2O100ml；
    2.7％聚丙烯酰胺：30％聚丙烯酰胺23.3ml、10ml10×TBE溶液、66.7mlDDH2O；
    3.10×TBE溶液：Tris113g、硼酸55g、1000mlDDH2O；
    4.1×TBE溶液：10×TBE溶液100ml，900mlDDH2O；
    5.10%乙醇；
    6.0.1%**；
    7.0.2%AgNO3：
    8.AgNO30.15g、DH2O225ml；
    9.30%NaCO3-甲醛：NaCO330g、甲醛0.85ml；
    10.0.1%AgNO3：AgNO31g、1000mlDH2O；
    11.上样缓冲液：0.25％二甲苯*蓝、0.25％溴酚蓝；
    12.TEMED；
    13.10％过硫酸胺：过硫酸胺1g、10mlDDH2O。

    实验设备
    1.垂直电泳仪
    2.垂直电泳槽
    3.玻璃
    4.橡胶模框
    5.点样梳
    6.摇床
    7.微量进样器
    8.染色托盘
    实验材料
    PCR扩增产物

    实验步骤
    1.电泳槽玻璃板的处理：用洗涤剂清洗玻璃板，自来水反复冲净洗涤剂，双蒸水冲洗3次，烘干，将两块玻璃装入恰当德橡胶模框内，并组装好电泳槽（带长玻璃的贮液槽为正极，带短玻璃的贮液槽为阴极）。
    2.制胶：加35μlTEMED和300μl2.5％过硫酸胺至7％聚丙烯酰胺溶液中混匀。以60O角，缓慢注入两玻璃板间的空隙中，直至灌满模具顶部。立即插入相应的点样梳，（小心勿使梳齿下带进气泡，并且不要将梳齿全部插入胶内，留约2mm梳齿于玻璃板上端，以免拔梳时把胶孔拔断）。由于凝胶在聚合过程中有回缩，所以应小心添加些胶液于梳子处，水平放置，室温聚合1小时。向电泳槽内灌入1×TBE电泳缓冲液。小心取出点样梳，用槽内的缓冲液反复冲洗点样孔，以去除可能存在的未聚合的聚丙烯酸胺和气泡。
    3.加样：取2-4μl扩增产物和2μl上样缓冲液混匀,用微量进样器小心加入样品槽中。若DNA含量偏低,则可适当增加上样量,但总体积不可超过样品槽容量。
    4.电泳：电泳槽接上电极开启电源，根据扩增片段的大小及电泳槽和凝胶的大小，决定电泳的电压及电泳时间。通常室温下以l～5V／cm电泳。当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时,停止电泳。

    5.银染法显色：
    1)方法一：
    a.将PAG板浸入10%乙醇溶液固定10min，用纯水洗一次；
    b.0.1%**3min，蒸馏水洗两次。
    c.0.2%AgNO3溶液中10min，用去离子水洗三次；
    d.用30%NaCO3-甲醛溶液显色至满意为止，用适量10%冰乙酸终止显色。
    2)方法二：
    a.取下凝胶，蒸馏水清洗凝胶30秒；
    b.0.1%**银染色10分钟；
    c.弃去染色液，蒸馏水洗胶两次；
    d.显色液（显色液配方：10gNaOH0.2gNa2CO32ml甲醛溶液，定溶到500ml）显色至满意为止。
    6.分型：参照基因阶梯的电泳谱带进行分型。

    注意事项
    1.每加完一个样品要清洗微量进样器,以防止互相污染,注意上样时要小心操作,避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。
    2.以二甲苯*蓝和溴酚蓝的位置大致判断泳动距离，7％聚丙烯酰胺非变性胶中溴酚蓝相当于170bp的泳动距离，二甲苯*蓝相当于40bp的泳动距离。
    3.银染时显色液配制好在4-10℃预冷可以减轻胶板的底色，银染后胶板在水中漂洗时间控制在10s以内。