基本信息
货号：13601
储存条件：保存在冰箱中，避光
适用仪器：荧光显微镜
简介
组蛋白去乙酰化酶（HDAC）是一类从组蛋白上的ε-N-乙酰基赖氨酸氨基酸中除去乙酰基的酶。去乙酰化恢复赖氨酸氨基酸的正电荷，这增加了组蛋白对DNA的带负电荷的磷酸骨架的亲和力。该过程通常通过阻断转录因子的进入来下调DNA转录。正在研究HDAC抑制剂作为癌症的治疗方法。
我们的Amplite™荧光HDAC活性检测试剂盒为检测HDAC活性提供了一种快速，方便，灵敏的方法。该试剂盒使用我们的非肽HDAC Green™底物，它比基于肽的HDAC底物（如Ac-RGK（Ac）-R110，Ac-RGK（Ac）-AMC和Ac-RGK（Ac） - 更敏感 - AFC。此外，HDAC Green™底物比其他商业肽基HDAC底物更耐蛋白酶水解。我们的试剂盒可用于测量细胞裂解液中的HDAC活性或用细胞提取物或纯化酶筛选HDAC抑制剂。 HDAC Green™底物的长波长发射使得该测定不受化合物和细胞组分的干扰。用490nm的激发和525nm的发射监测HDAC活性。
试剂盒主要特点
广泛应用：可用于量化溶液和细胞提取物中的HDAC。
连续性：无需分离步骤即可轻松适应自动化。
方便：配方具有最小的手动操作时间。 不需要洗涤。
非放射性：对废物处理没有特殊要求。
试剂盒组成
96孔板样品测定方案
简要概括
准备含有HDAC的样品（40μL）®
添加HDAC抑制剂或测试化合物（10μL）®
在室温或37 oC孵育10-20分钟®添加HDAC Green™底物工作溶液（50μL）®
在室温下孵育或 37 oC持续30-60分钟®
在Ex / Em = 490/525 nm处监测荧光强度
操作步骤
1.准备工作解决方案：
1.1制备含有HDAC的测试样品：在测定缓冲液（组分B）中以1:40稀释5-10mg / mL HeLa核提取物或细胞裂解物。
注意：40μL稀释样品足以用于96孔板的一个孔。使用前立即稀释提取物。将溶液储存在冰上。
1.2制备HDAC抑制剂（Trichostain A）溶液的稀释液：在测定缓冲液（组分B）中以1：100稀释3mM曲古抑菌素A溶液（组分C），得到30μM曲古抑菌素A溶液。向每个抑制剂对照孔中加入10μL30μM曲古抑菌素A溶液。
1.3准备HDAC Green™底物工作溶液：将20μLHDACGreen™底物（组分A）和100μL信号增强剂（组分D）加入5 mL分析缓冲液（组分B）中。
注意1：稀释的HDAC Green™底物工作溶液不稳定，5 mL稀释的HDAC Green™底物工作溶液足以进行100次分析。
注2：为每个实验准备新鲜的HDAC Green™底物工作溶液。将重构的工作溶液保持在冰上直至使用。
2.运行HDAC分析：
2.1将40μL稀释的核提取物，酶溶液或其他HDAC样品和10μL测试化合物加入相应的微孔板孔中（见表1）。
对于阳性对照：加入40μL稀释的HDAC酶溶液或HeLa核提取物（来自步骤1.1）和10μL分析缓冲液（组分B）。对于阴性对照：加入40μL稀释的HeLa核提取物（来自步骤1.1），加入10μL μL的30μM曲古抑菌素A溶液（来自步骤1.2），或使用不含HDAC活性的已知样品。对于空白（无酶）：仅添加50μL的测定缓冲液（组分B）。
2.2在室温或37℃孵育平板10-20分钟。
注意：为了筛选HDAC抑制剂，在添加HDAC Green™底物工作溶液之前，先用HeLa核提取物或纯酶预孵育这些化合物（参见步骤2.3）
2.3将50μLHDACGreen™底物工作溶液（来自步骤1.3）加入每个孔中。将板在室温或37℃孵育30-60分钟。
2.4在Ex / Em = 490/525 nm处监测荧光强度。
表1.在96孔微孔板中的测试化合物的核提取物的布局
数据分析
空白孔中的荧光（仅使用测定缓冲液）用作背景荧光，并且用具有HDAC Green TM反应的那些孔的值减去。 所有荧光读数均以相对荧光单位（RFU）表示。 典型数据如图1所示。
图1.曲古抑菌素A使用Gemini荧光酶标仪（Molecular Devices），用Amplite TM荧光HDAC活性测定试剂盒测量HeLa核提取物中的抑制。
图2.使用Amplite™荧光测定法测定HeLa核提取物中的HDAC活性HDAC活性测定试剂盒（蓝色）与供应商X（红色）和供应商Y（绿色）进行比较，两者均使用Ac-RGK（Ac） -R110肽底物。 使用Amplite™荧光HDAC活性测定试剂盒测量的HDAC活性的信号/背景比率比供应商X和Y高10倍以上。
参考文献
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