高危神经母细胞瘤(NB)常涉及MYCN扩增和ALK突变。目前，高危NB存在重大的临床挑战，需要更多的治疗选择。
瑞典和比利时的科学家合作在Nature Communications （中科院JCR一区，影响因子：14.919）上发表了题为“ATR inhibition enables complete tumour regression in ALK-driven NB mouse models”的论文。通过磷酸化蛋白组学结果发现ALK驱动的NB细胞中存在着ATR的激活，抑制ATR可显著阻碍肿瘤细胞生长和增殖，甚至可以使ALK驱动的神经母细胞瘤完全消退。最后通过RNA测序、蛋白质组学和磷酸化蛋白组学，表征了NB细胞和肿瘤对ATR抑制的应答，将DNA损伤反应的关键成分确定为NB 细胞中的 ATR 靶点。本研究为高危神经母细胞瘤的治疗提供了一个潜在的机会。
研究思路
1. 磷酸化蛋白质组学：ATR是ALK信号的靶点
作者此前用ALK酪氨酸激酶抑制剂（TKI）处理ALK驱动的NB细胞，并通过磷酸化蛋白组学检测发现了ALK抑制后会导致Sad1和SUN2蛋白N端的丝氨酸和苏氨酸磷酸化的显著变化。此外，ATR丝氨酸435、436和437的磷酸化也下调。而抗ATR/ATM底物抗体的富集产物中发现了SUN2磷酸化，这增加了NB细胞中ALK活性调节ATR/ATM活性的可能性。进一步，在NB细胞中，抗pALK/ATM底物motif的抗体富集后能检出SUN2，而不管是用ALK酪氨酸激酶抑制剂lorlatinib，还是ATR抑制剂BAY 1895344处理NB细胞，抗体IP产物中检出的SUN2都减少。这些结果意味着，ALK驱动的NB细胞中存在着ATR的激活。
2. ALK驱动的NB细胞系对ATR抑制敏感
作者分析了一个已发表的NB数据，发现高表达的ATR与预后差具有相关性。作者继续在9个不同基因背景的NB细胞系中检测ATR/pATR和相关的ATM/pATM及下游信号组分FOXM1/pFOXM1 和CHK1/pCHK。所有NB细胞系中均检测到了pATR、 pATM、pFOXM1和 pCHK1。这意味着这些细胞系存在着基础的DNA损伤响应（DDR）。随后，作者用ATR抑制剂BAY 1895344处理两个由ALK驱动的NB细胞系，这两个细胞系均对ATR抑制剂表现出高敏感性。
3. ATR抑制剂阻碍NB细胞生长并不受细胞ALK和MYCN状态的影响
前面的研究表明，pATR在NB细胞系中广泛表达，包括非ALK驱动的NB细胞。作者进一步在非ALK驱动的NB细胞中检测ATR抑制剂对细胞生长的影响。结果显示，所有的非ALK驱动的NB细胞也对ATR抑制剂BAY1895344敏感。同时，作者还发现，在ATR抑制剂造成了DNA损伤响应相关蛋白和凋亡的上调，该结果在siRNA介导的ATR敲低 NB细胞中得到进一步证实。
4. ATR抑制的NB细胞的转录组和蛋白质组变化
为了研究抑制ATR后的下游基因表达响应，作者分别对ATR抑制剂BAY1895344处理0h、24h和48h的NB细胞（CLB-BAR和CLB-GE细胞系，均受ALK驱动）进行转录组和蛋白质组学检测。转录组结果显示，CLB-GE细胞在处理48h后显示出最多的基因表达变化（370个上调，198个下调）。这些下调基因几乎都在48h才显示出变化，它们主要是一群转录因子E2F靶向的细胞周期相关基因以及G2/M细胞周期检查点基因。上调基因包含了一群富集在p53通路的基因。蛋白质组学呈现了类似的结果：基于GSEA的转录因子预测确认了E2F转录因子的关键作用，同时发现了其他转录因子，如参与DNA损伤响应（DDR）的RAD51和BRCA1/2。
作者监测了细胞周期过程中ATR的下游靶点pFOXM1(T600)和pChk1(S345)的水平。
结果表明，胸腺嘧啶阻滞解除后，在BAY1895344抑制的CLB-BAR细胞中，pFOXM1表达增强。在BAY1895344抑制的CLB-GE细胞中，观察到pFOXM1和pCHK1的类似变化。同时还发现，与ATR抑制相比，ALK抑制剂对pFOXM1没有影响。因此，在NB细胞中，ATR对S/G2检查点的调控是保守的。
为了进一步研究ATR抑制剂BAY1895344对NB细胞的影响，作者使用抑制剂对从胸腺嘧啶阻滞解放出来的CLB-BAR细胞进行处理，并检测处理6h后的磷酸化蛋白质组学变化。共鉴定到4087个蛋白上的14528个磷酸化位点。ATR自磷酸化位点T1989以及另外的S435都发生了去磷酸化。其他磷酸化下调的ST/Q位点包括AEBP2 S167、 UTP14A S445、DCK S74 和CASC3 S10 。非ST/Q位点包括ATR底物 FANCD2 T716、E2F3 S172/166、 SLBP S110 和TOPBP1 S888。特别地，下调磷酸化位点中还发现了DNA损伤响应相关蛋白，如ATRX、FANCI、EXO1和WRN。下调磷酸化位点富集在DNA修复及相关通路如G2M检查点和范康尼贫血通路。作者的磷酸化蛋白组同时发现，大量下调的磷酸化位点并不包含ATR底物的S/TQ motif，这意味着，蛋白磷酸化的变化并不是一种直接的调控，而是二级调控结果。总体，磷酸化蛋白质组学发现了DNA损伤响应组分及E2F3和DCK是ATR作用的靶点。
7. ATR抑制剂对NB细胞及小鼠移植瘤的影响
（1）ATR抑制剂（BAY1895344）抑制NB细胞增殖并诱导细胞死亡
BAY1895344和lorlatinib(一种ALK酪氨酸激酶抑制剂)单独处理NB细胞显著抑制了癌细胞的增殖，而BAY1895344和lorlatinib联合治疗能进一步抑制癌细胞增殖。
（2）BAY1895344抑制小鼠异种移植瘤的生长
BAY1895344和lorlatinib单独或联合治疗CLB-BAR细胞的小鼠移植瘤模型均显示出显著的抑制移植瘤生长的作用。
8. ATR抑制剂和ALK抑制剂联合治疗，消除了ALK驱动的NB基因工程小鼠的肿瘤
作者在两个ALK驱动的NB基因工程小鼠模型（Rosa26_Alkal2；Th-MYCN (n = 4)和Alk-F1178S；Th-MYCN(n = 4)）上检测了BAY1895344和lorlatinib联用的治疗效果。14天的药物联用治疗后，所有小鼠均未检测到肿瘤，而对照组则有显著的肿瘤生长。单独的lorlatinib治疗可以减少肿瘤增长，但并不能使肿瘤完全消退。在一个疗程的药物联用治疗结束后，作者继续跟踪了小鼠的肿瘤生长，通过超声和MRI检测确认在治疗开始后的第50天，肿瘤也是完全消退的。在治疗结束更久的时间后会发生肿瘤的复发，但继续进行药物联用治疗依然有抗肿瘤响应。对比药物联用和单独使用lorlatinib可以确定，BAY1895344和lorlatinib联用可使ALK驱动的NB肿瘤完全消退。
通过转录组分析ATR抑制剂（BAY1895344）治疗ALK驱动的NB基因工程小鼠（Rosa26_Alkal2；Th-MYCN (n = 3)和Alk-F1178S；Th-MYCN(n = 3)））的作用机制。两个不同小鼠模型RNA测序分别发现了603和2220个差异基因，这些差异基因与此前在NB细胞系中发现的差异基因大致相同，都显示了E2F转录因子靶基因和G2M检查点相关蛋白的富集。免疫组化也证实了BAY1895344治疗后，肿瘤细胞凋亡增加、增殖减少。由于FOXM1是ATR的磷酸化靶点，作者观察到在BAY1895344治疗的肿瘤中，pFOXM1的亚细胞定位发生了显著变化。治疗前，pFOXM1定位于细胞核中，而在治疗后，pFOXM1则定位于细胞质中。此外，作者还发现，BAY1895344治疗诱导了强烈的免疫响应。
最后，GSEA分析发现的标志基因集与此前NB细胞系中发现的几乎相同。如，与ATR表达正相关的基因显著富集在E2F转录因子的细胞周期相关靶点和G2/M检查点，与ATR表达负相关的基因富集在包括p53通路在内的其他通路。该结果也表明了ATR抑制造成的基因表达的变化在作者的模型中具有高特异性。
研究总结
本研究通过在细胞系、异种移植瘤模型以及基因工程小鼠模型中确认了ATR抑制剂BAY1895344是一种有效的神经母细胞瘤抑制剂。尤其是，14天的ATR和ALK抑制剂联合治疗方案完全消除了所有ALK驱动的NB基因工程小鼠的肿瘤。ATR抑制剂治疗后的基因工程小鼠的磷酸化蛋白质组学和转录组分析发现，药物治疗引起了强烈的E2F转录因子的响应，该结果与细胞系上的转录组和蛋白组学发现一致。此外，研究还发现，ATR抑制剂抑制ATR后，伴随着炎症特征和广泛的肿瘤免疫浸润，这意味着ATR抑制不会对免疫反应产生负面影响。综上所述，这些结果强烈表明抑制ATR对ALK驱动的神经母细胞瘤有有效的治疗效果，具有潜在的临床应用价值。
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