单细胞蛋白质组学（single-cell proteomics, SCP）是一种专注于解析单个细胞中蛋白质组成和功能的前沿分析技术。单细胞蛋白质组学能够提供更细致的细胞层面信息，有效揭示单细胞之间的内在异质性，与传统的大规模蛋白质组学相比，弥补传统方法仅提供样本总体或平均表达水平的不足。在植物研究中，单细胞蛋白质组学突破了因细胞壁结构导致传统技术难以解析单一植物细胞蛋白质的局限性，可揭示植物细胞间异质性，深入解析植物基因调控网络和细胞功能特性。基于此，2024年爱荷华州立大学研究团队以拟南芥为模型，通过单细胞蛋白质组学技术成功区分了根部内胚层和皮层细胞，为植物单细胞研究提供了理论依据和技术支持。作为专业服务商，百泰派克生物科技利用全流程集成自动化的单细胞分选平台——CellenONE，为科研人员提供高质量、精准的单细胞蛋白质组学分析服务，为解决植物研究中复杂细胞异质性问题提供创新解决方案。
拟南芥是植物学中常用的模式植物，因其根系细胞类型明确且分布规律，成为研究植物细胞异质性的理想模型。根系是植物重要的吸收和运输器官，其不同细胞类型在生理功能和响应外界刺激上各有不同。传统的蛋白质组学方法无法精确区分根系中不同细胞类型之间的蛋白质表达差异，而单细胞蛋白质组学为此提供了一种创新的解决方案。爱荷华州立大学研究团队通过对拟南芥根细胞类型的单细胞蛋白质组分析，为深入理解植物根系的功能分化及其在环境适应中的作用提供了理论依据，以下是其主要研究结果：
一、方法学改进及数据质量评估
拟南芥的根是一个特征明确的器官，具有明确的细胞类型，使其成为植物SCP基准的优秀系统。选择关注两种细胞类型，皮层和内胚层，这两种细胞来源于一种常见的干细胞谱系。在根内，这两种细胞类型在物理上彼此相邻（图1）。根部被酶解释放原生质体，然后分别用流式细胞仪分离内胚层或皮层原生质体。最终，每种细胞类型的384个原生质体放置在384孔板上。
图1. 拟南芥内胚层和皮层单细胞蛋白质组学方法
使用改进的方法进行前处理和标记上机，分析756个单个细胞。所得到的原始数据最初使用MaxQuant进行搜索，评估了数据的灵敏度和一致性（图2）。最终鉴定了3763个蛋白质，平均每个细胞1118个蛋白质。
图2. 单细胞蛋白质组学数据评估
计算肽变异系数（CV），并去除具有极端肽CV（> 0.69）的细胞。还去除了在< 98%的细胞中定量的蛋白质，以生成严格的过滤列表。虽然这种严格的过滤将细胞数量减少到81个（33个内胚层细胞和48个皮层细胞），但能够在这些细胞中量化3217个蛋白质。推测这可能是由于根细胞大小的差异（每个细胞的总蛋白）导致的，因为沿着根的长度存在细胞大小的梯度。此外，包括根在内的许多植物组织中的细胞都经历了基因组内重复。虽然这通常会导致细胞变大，但细胞大小的增加是非线性的，这表明在植物SCP研究中，鉴定组蛋白以外的正常化因子是必要的。细胞大小可变性可能导致定量变化的问题也可以在未来使用能够不仅基于荧光而且基于细胞大小/形态进行分选的仪器进行研究，例如cellenONE。
二、数据检查
对定量蛋白进行检测，以探索SCP检测到的蛋白的特征。首先观察SCP是否检测同源转录物高度丰富的蛋白质。绘制了拟南芥根系单细胞RNA-seq图谱中检测到的转录本，发现在SCP中检测到的蛋白质跨越了低到高丰度转录本的范围，并偏向于丰富的转录本。最后，检查了SCP是否量化与信号相关的蛋白质，这些蛋白质通常含量较低。具体来说，检查了是否量化了激酶和转录因子。在3217个定量蛋白中，观察到175个激酶和188个转录因子，表明信号相关蛋白很容易通过SCP测量。
三、结果分析
接下来，研究了严格过滤组的内胚层和皮层细胞蛋白质组的差异。前25%最易变蛋白的PCA和UMAP显示了内胚层和皮层细胞之间的明显分离（图3）。
图3. PCA和UMAP图
还进行了差异表达分析，并鉴定出596种蛋白在内胚层和皮层细胞中差异积累(图4a)。在预期的细胞类型中观察到已知蛋白的富集（图4a）。例如，CASPARIAN STRIP MEMBRANE DOMAIN PROTEIN 1在内胚层细胞中富集，这与它作为参与CASPARIAN STRIP （CS）形成的内胚层标记物的已知作用一致。此外，YUCCA 2中的NAKED PINS在内胚层细胞中富集，据报道，它可以控制PIN-FORMED 1亚细胞的基底定位和根向地性反应。研究还发现了内胚层细胞富含呼吸爆发氧化酶同源物D，已知在内胚层细胞中激活活性氧依赖的信号以帮助CS形成。
图4. 差异表达分析
在皮层内，几个关键的标记蛋白被富集。这包括生长素反应因子5，已知其可驱动皮质细胞分裂。共伴侣蛋白P23-1也在皮质细胞中富集，该蛋白在建立生长素分布和维持皮质细胞适当数量方面发挥了重要作用。最后，研究发现蛋白酶体19S调节颗粒8a在皮质中富集，已知它可以影响BRAHMA的稳定性，从而促进硼耐受性。为了识别两种细胞类型中鉴定的蛋白质之间的共同和独特特征，对两种细胞类型（列）和蛋白质（行）进行了分层聚类（图4b）。该分析显示，来自内胚层的细胞倾向于聚集在一起，来自皮层的细胞也是如此，这表明基于细胞起源的明显聚类（图4b）。
近年来，样品制备、液相色谱和质谱技术的进步显著提高了单细胞蛋白质组的检测能力，将蛋白质检测能力从几百个提高到几千个。在这一背景下，爱荷华州立大学研究团队成功地利用单细胞蛋白质组学分析了拟南芥根部不同细胞类型的蛋白质表达谱，结果表明单细胞蛋白质组可区分拟南芥根细胞类型，这不仅证明了单细胞蛋白质组学在植物中的可行性，也揭示了植物根部细胞类型间复杂的蛋白质调控机制。
作为一家专注于生物制品表征和多组学生物质谱检测的高品质服务商，百泰派克生物科技致力于为客户提供专业的单细胞蛋白质组学分析服务。凭借丰富的经验和先进的技术，我们为植物研究提供高质量的数据支持。无论是深入解析植物细胞类型，还是精准测定复杂生物体系中的蛋白质表达差异，百泰派克生物科技都能为您量身定制解决方案，助力您的科研突破。
参考文献：Montes C, Zhang J, Nolan TM, Walley JW. Single-cell proteomics differentiates Arabidopsis root cell types. New Phytol. 2024 Dec;244(5):1750-1759. doi: 10.1111/nph.19923. Epub 2024 Jun 24.
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