简介

ReadiLink™快速抗体标记试剂盒提供了一种以微观方式标记抗体的最便捷方法。 该试剂盒仅需要两个简单的混合步骤而无需纯化步骤。 试剂盒中使用的iFluor TM和mFluor TM染料的琥珀酰亚胺酯（SE）显示出与蛋白质的脂族胺的良好反应性和选择性，并形成羧酰胺键，其与天然肽键相同且稳定。 iFluor TM和mFluor-抗体缀合物可用于免疫荧光染色，荧光原位杂交，流式细胞术和其他生物学应用。 每个ReadiLink™Rapid抗体标记试剂盒都提供了进行两次偶联反应（2x50μg蛋白质）的所有必需成分。 每个试剂盒可用于标记50-100μg单克隆，多克隆抗体或其他蛋白质（> 10 kDa），只需两个简单的混合步骤。

Readilink™快速试剂盒标记原理

1.通过在反应缓冲液（pH 7.5-8.5）中将标记染料与蛋白质（待标记的）混合，开始标记反应。

2.孵育得到所需蛋白质缀合物和非反应性游离染料的混合物。

3.通过将非荧光Tide Quencher TM（TQ）染料与反应溶液混合来淬灭反应。 TQ染料阻止反应并将非反应性自由标记染料转化为非荧光TQ标记染料复合物，这消除了游离标记染料的背景荧光干扰。

试剂盒组成

标准操作规程（标记50μg蛋白质）

将所有组分加热并在打开前将样品瓶短暂离心，并在开始结合前立即准备所需的溶液。 以下SOP是标记抗HDAC IgG抗体的实例。

1.准备蛋白质溶液（溶液A）：

为了标记50μg蛋白质（假设目标蛋白质浓度为1 mg / mL），将5μL（总反应体积的10％）反应缓冲液（组分B）与50μL目标蛋白质溶液混合。

注意1.如果蛋白质浓度不同，请相应调整蛋白质体积，使~50μg蛋白质可用于标记反应。

注2：为了标记100μg蛋白质（假设目标蛋白质浓度为1 mg / mL），将10μL（总反应体积的10％）反应缓冲液（组分B）与100μL目标蛋白质溶液混合。

注3：蛋白质应溶解于pH7.2-7.4的1X磷酸盐缓冲盐水（PBS）中;如果蛋白质溶解在甘氨酸缓冲液中，必须用1X PBS（pH 7.2-7.4）透析，或使用Amicon Ultra-0.5，Ultracel-10膜，10 kDa（来自Millipore的cat＃UFC501008）去除游离胺或铵盐（如硫酸铵和乙酸铵）广泛用于蛋白质沉淀。

注4：用牛血清白蛋白（BSA）或明胶稳定的不纯抗体或抗体不能很好地标记。

注5：如果蛋白质浓度低于1 mg / mL，结合效率会显着降低。为获得最佳标记效率，建议最终蛋白质浓度范围为1-2 mg / mL。

2.运行结合反应：

2.1将蛋白质溶液（溶液A）加入一小瓶标记染料（组分A）中，通过反复移液几次将其充分混合，或将小瓶涡旋几秒钟。

注意：使用标记染料的两个小瓶（组分A）通过将100μg蛋白质分成2x50μg蛋白质并使每个50μg蛋白质与一小瓶标记染料反应来标记100μg蛋白质。 将两个小瓶合并用于下一步。

2.2将缀合反应混合物在室温下保持30-60分钟。

注意：如果需要，可以旋转或摇动缀合反应混合物更长的时间。

3.停止共轭反应：

3.1加入5uL（50μg蛋白质）或10μL（100μg蛋白质），这是TQ染色猝灭缓冲液（组分C）总反应体积的10％到共轭反应混合物中（来自步骤2.2），混合 他们很好。

3.2在室温下孵育10分钟。

3.3标记的蛋白质（抗体）现在可以使用了。

蛋白质共轭物的储存

蛋白质缀合物应在载体蛋白（例如0.1％牛血清白蛋白）存在下以> 0.5mg / mL储存。 为了更长时间的储存，可以将蛋白质缀合物冻干或分成单次使用的等分试样并在≤-20℃下储存。

表1. AAT Bioquest ReadiLink™快速抗体标记试剂盒（2个标记/试剂盒，每个标记适用于50μg抗体）

参考文献

1. Hermanson GT (1996). Biocojugate Techniques, Academic Press, New York. 2. Haugland RP (1995). Coupling of monoclonal antibodies with fluorophores. Methods Mol Biol 45, 205-21.

3. Brinkley M (1992). A brief survey of methods for preparing protein conjugates with dyes, haptens, and cross-linking reagents. Bioconjugate Chem 3, 2-13.