大鼠核因子қb(NFқb)酶联免疫分析(ELISA)-分析方法-资讯-生物在线

大鼠核因子қb(NFқb)酶联免疫分析(ELISA)

作者:上海研辉生物科技有限公司 2011-09-13T00:00 (访问量:1664)

大鼠核因子қb(NFқb)酶联免疫分析(ELISA

试剂盒使用说明书

本试剂盒仅供研究使用。

药品名称:

通用名:大鼠核因子қb (NFқb)酶联免疫分析试剂盒

使用目的:

本试剂盒用于测定大鼠血清、血浆、或相关组织液中核因子қb (NFқb)含量。

实验原理

本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中大鼠核因子қb 水平。用纯化的大鼠核因子қb抗体包被微孔板,制成固相抗体,往包被单抗的微孔中加入核因子қb,再与HRP标记的核因子қb抗体结合,形成抗体-抗原-酶标抗体复合物,经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMBHRP酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的核因子қb呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),通过标准曲线计算样品中大鼠核因子қb (NFқb)的含量。

试剂盒组成

1

20倍浓缩洗涤液

30ml×1

7

终止液

6ml×1

2

酶标试剂

6ml×1

8

标准品(1350ng/L

0.5ml×1

3

酶标包被板

12孔×8

9

标准品稀释液

1.5ml×1

4

样品稀释液

6ml×1

10

说明书

1

5

显色剂A

6ml×1

11

封板膜

2 

6

显色剂B

6ml×1/

12

密封袋

1

标本处理及要求

1.血清、血浆标本可直接测定;

2.尿液、脑脊液、腹腔液:2000-3000/分离心10分钟后,取上清液待测。

3.不能检测含NaN3的样品,因NaN3抑制辣根过氧化物酶的(HRP)活性。

4.采集后尽早进行实验,若不能马上进行试验,可将标本放于-20保存,但应避免反复冻融。

操作步骤

1.         标准品的稀释与加样:在酶标包被板上按序设标准品孔10孔,在第一、第二孔中分别加标准品100μl,然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl,混匀;再各取100μl分别加到第三孔和第四孔,再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl,混匀后,在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉;再各取50μl分别加到第五、第六孔中;再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul,混匀;混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中;再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl,混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中;再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl,混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。( 稀释后各孔加样量都为50μl,浓 度分别为 900 ng/L600ng/L 300 ng/L150 ng/L75 ng/L)。

2.         加样:分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂,其余各步操作相同)、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl,然后再加待测样品10μl(样品最终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部,轻轻晃动混匀。

3.         温育:用封板膜封板后置37℃温育30分钟。  

4.         配液:将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用

5.         洗涤:小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置30秒后弃去,如此重复5次,拍干。

6.         加酶:每孔加入酶标试剂50μl,空白孔除外。

7.         温育:操作同3

8.         洗涤:操作同5

9.         显色:每孔先加入显色剂A50μl,再加入显色剂B50μl,轻轻震荡混匀,37℃避光显色15分钟.

10.     终止:每孔加终止液50μl,终止反应(此时蓝色立转黄色)。

11.     测定:以空白空调零,450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。 测定应在加终止液后15分钟以内进行。

 

计算

  以标准物的浓度为横坐标,OD值为纵坐标,在坐标纸上绘出标准曲线,根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度;再乘以稀释倍数;或用标准物的浓度与

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